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  血液循環腫瘤細胞(Circulating Tumor Cells, CTC)是指進入到血液循環中的腫瘤細胞。部分CTC可以逃離機體免疫識別或藥物治療,在體內尋找合適的微環境,形成“種子”在遠端組織器官或原發組織種植生長,造成腫瘤的轉移或復發。CTC檢查是測定血液中流動癌細胞的一種檢查。通過CTC檢查能夠識別出影像檢無法發現的超早期微小癌,臨床上能夠比以往傳統的診斷方法更早的發現腫瘤,能得知超早期的原發癌發病率,以及超早期的癌癥轉移或復發。肺癌、直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等腫瘤患者CTC是血中觀察腫瘤預后治療效果的重要生物標記物。腫瘤病人血中CTC數目越多,病人的預后越差。


  CTC與腫瘤的生長和轉移

  

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  T≤ 0.05mm:血液循環中無CTC,腫瘤不可被檢測出;

  T ≥ 0.5mm:血液循環中出現CTC,腫瘤仍然不能被影像學檢測出;

  T ≥ 5mm:血液循環中出現CTC,腫瘤可以被影像學檢測出;腫瘤的細胞數是109,~10億個;

  T ≥ 50mm:血液循環中大量出現CTC,腫瘤出現轉移。


  CTC的俘獲

  CTC基于俘獲的原理有兩大類,化學方法和物理方法。


  化學方法

  1) 化學方法主要是基于CTC是上皮細胞,大多數的上皮細胞的表面有一些特異的抗原標記物如EpCAM, Cytokeratins等,利用外來的抗體與抗原的結合就可以把CTC從血液中分離出來?;诳贵w的載體的不同,又有一些不同的分類。


  a) 一類是抗體涂在固定的表面如微柱或者微腔如微流體控的裝置-通過增大抗原和抗體接觸面積來增加CTC的俘獲。


b) 另一類是抗體涂在流動的表面如磁珠,通過外加的磁性引力來達到純化和富集的目的。如通過FDA的Cellsearch?或國內類似的產品。


  2) 化學方法根據CD45的表達又分為陽性和陰性兩種方法。這是基于CTC等上皮細胞不表達CD45。他們都利用了CTC不表達CD45的特點,把白細胞去掉。


  3) 基于抗原和抗體的化學方法無論載體如何改變都無法克服技術本身的缺點:


  a) 抗原與抗體的結合容易致CTC的凋亡,使得俘獲的CTC數目減少。這點已經被證實,這也是Cellsearch?雖然通過FDA的批準但在臨床上得不到應用的主要原因之一。

  c) 不能俘獲EMT細胞-即從上皮到間質轉化的細胞,這類細胞不表達傳統的上皮細胞表面抗原標記物,所以不被抗體識別和俘獲。這類細胞惡性度最大,是腫瘤轉移的元兇。血液中有EMT細胞即表示患者預后不好。


  物理方法

  物理方法是根據細胞的形態大小和密度的不同。根據形態大小的不同是主流。這類方法簡便,不易致CTC的凋亡,也能俘獲EMT細胞。第一代的產品存在CTC的俘獲純度低的缺點,是由于膜自身的缺點引起的。俘獲后的CTC可以用于下游一系列的檢測,如FISH檢測染色體重組,免疫組織化學的CTC分型,CTC的基因測序,熒光定量基因表達水平的改變,細胞培養用于抗腫瘤的藥物敏感試驗和新的抗腫瘤藥物的開發。


  CTC在臨床中的主要應用


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  液態活檢是一種非侵入式、多次式的血液檢測方式。與傳統的固態活檢相比,液態活檢采集患者5~10ml 血液,采樣方便,且涵蓋了健康人的早期腫瘤篩查、后期腫瘤患者靶向用藥治療和預后,優勢明顯。液態活檢主要涉及CtDNA和CTC。


  CtDNA:是指來源于血液中腫瘤細胞即CTC釋放的DNA。它是血中腫瘤細胞凋亡后釋放出的小分子片段的DNA。腫瘤細胞的凋亡是不同于死亡的一種生物學過程。多種外在因素的刺激啟動了細胞內部細胞凋亡途徑而發生的。有文獻報道腫瘤患者手術后 ctDNA顯著性的下降,這給檢測技術提出了更高的要求。當血液中的ctDNA含量低時,就需要檢測靈敏度更高的技術,該技術能夠區分微小的基因突變信號和背景信號。因此,ctDNA檢測面臨著開發出高靈敏度的基因突變檢測技術的難點。


  cfDNA:是指血液中無細胞的DNA。它主要來源于血液中凋亡的白細胞,只有很少的一部分來源于血中的腫瘤細胞,僅占<0.01%。來源于白細胞的DNA不帶有任何腫瘤的信息,在腫瘤的液態活檢中沒有的意義。但白細胞的克隆性造血現象會造成大量的基于CtDNA的基因突變檢測結果的假陽性,把腫瘤的精準治療引向危險的境界。


  意義不明的克隆性造血(Clonal hematopoiesis of indeterminate potential, CHIP )是指由一個造血干細胞或者其他早期的起始血細胞為了更好的適應環境而發展成一個帶有一些基因變異的亞型。這個亞型帶有基因變異一般是非驅動性的,而且該亞型占血細胞的比率跟年齡有很大的相關性??寺⌒栽煅梢苑譃閮煞N情況,一種是正常人因機體老化出現克隆性造血,另一種是白血病患者治療后長期生存或無病狀態下的克隆性造血。


  1) 研究表明,40歲以下的該亞型的比率只有少于1%,而超過70歲的,可能比率會高達10%~20%。


  2) 在做cfDNA檢測中,如果在抽提cfDNA時,沒有將白細胞完全清楚干凈,那么帶有白細胞的cfDNA的檢測結果可能會出現幾十個低頻的非驅動性變異,一般頻率會低于5%。


  3) 隨著ctDNA檢測技術的不斷發展,越來越多研究者開始關注意義未明的克隆性造血(CHIP)現象,即在白細胞小克隆群體中癌癥相關基因的突變累積。無論是進行組織測序還是液態活檢,CHIP的危害在于這些克隆突變可能被誤認為是體細胞突變,進而在腫瘤組織測序后導致患者接受錯誤治療,或引起癌癥液體活檢結果的假陽性。


  4) 美國GRAIL 公司CCGA的研究結果顯示在這項研究中,對肺癌患者的檢測中超過54%的體細胞突變都是來源于白細胞,而不是腫瘤。在1400多個CCGA樣本中(576個對照樣本和836個患者樣本),7%的樣本中表現出變異等位基因頻率超過10%的克隆造血現象,約40%的樣本具有的VAF(Variant Allele Frequency) 頻率低于1%。更重要的是,克隆造血的VAF頻率在癌癥樣本和非癌癥樣本中是相似的。在鑒定到的CHIP變異中,超過90%都是個體特異性的。這意味著,在癌癥液體活檢方法中,并沒有某種生物信息學工具或其他捷徑可以解決克隆造血的干擾。


  5) CCGA的數據結果同時表明避免假陽性事件在cfDNA篩查中的必要性。


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  CTC在臨床應用上的優勢


  Chemi F等通過對100位早期非小細胞肺癌患者的研究發現(Nat Med 25, 1534–1539 ,2019)早期肺癌患者手術時的肺靜脈CTC(PV-CTC)能有效預測手術后的生存和復發情況。更值得關注的是,研究者運用高通量測序技術對腫瘤組織(原發灶多個部位、轉移灶)和液體活檢標本(CTC和cfDNA)進行基因分析,并分別對比了ctDNA、CTC與原發腫瘤、轉移病灶間的信息一致性,旨在揭示腫瘤演化軌跡,探尋轉移發生的分子機制,為臨床如何干預能有效降低肺癌復發率,預防轉移提供研究基礎。結果發現:

  (一) 肺癌早期的CTC比cfDNA攜帶更全面的腫瘤基因信息

  

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  肺癌早期CTC和ctDNA能否攜帶全面的腫瘤實時生物學信息,直接影響其在液體活檢領

  域的發展前景。本研究充分證實了CTC在全面反映腫瘤生物學信息中的獨特優勢。

  (二) 肺癌早期CTC與10個月后轉移灶基因突變一致性達到91%

  

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  肺癌早期PV-CTC91%的突變可在10個月后發生的轉移灶組織中檢出(181/198),而在原發灶該比例只有79%(157/198)。

  (三) 肺癌早期CTC與轉移灶屬于同一腫瘤進化分支,是肺癌復發的直接原因

  研究者通過系統的腫瘤進化生物學分析發現,肺癌早期CTC和轉移灶屬于同一特異的腫瘤進化分支,該分支與原發腫瘤截然不同。因此肺癌早期的CTC正是導致術后復發的直接原因。

  

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  腫瘤早期CTC不僅能攜帶原發腫瘤的突變信息,也能攜帶數月后發生的轉移灶突變信息,這提示了CTC在克服腫瘤時空異質性,提供腫瘤實時、全景基因突變譜的獨特優勢,CTC甚至為提前預知轉移機制、明確遏制轉移的治療靶點、降低肺癌術后復發率方面,展現了巨大的應用潛能。


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